293細胞比較容易轉(zhuǎn)染，是一個很常用的表達研究外源基因的細胞株。液氮罐

　　293細胞的一個衍生株：293T/17的轉(zhuǎn)染效率更高,，成為廣大研究者研究基因功能的一個強大工具,。293細胞的缺陷是生長過程中貼壁強度比較小,。所以在實驗過程中容易流失,，從而影響實驗結(jié)果,。如果一個實驗室新得到的293細胞是郵寄得到的并且細胞在培養(yǎng)瓶中,，就需要讓細胞沉降幾天時間,，因為大量細胞會漂浮在培養(yǎng)液里,。

　　293細胞系是原代人胚腎細胞轉(zhuǎn)染5型腺病毒(Ad 5) DNA的永生化細胞，表達轉(zhuǎn)染的腺病毒5的基因,。

　　來源：人體腎臟 形態(tài)：上皮細胞 生長特性：貼壁 注釋：該細胞含腺病毒5 DNA ,。

　　培養(yǎng)液： MEM( 含 2 mM L-谷氨酰胺 和 Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸鈉),， 10% 馬血清(熱滅活),。

　　傳代： 吸去培養(yǎng)液。 用0.25% (w/) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次,，以去除血清(血清會抑制胰酶的活性),。 加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約5分鐘,，直到細胞全部脫落,。 加6-8毫升培養(yǎng)液，用移液器把細胞吹散,。 加適量的細胞到新的培養(yǎng)器皿中,。(以1：2到1：4為宜，傳代期間培養(yǎng)液2-3天更換1次)

　　凍存：95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮,。

　　293A 比較有意思了,，是293中后來又建的細胞亞株，這個A是adhere的意思,，就是說293傾向于形成單層細胞(monolayer)，它比293好的地方是在做計算病毒數(shù)量的空斑試驗(plaque assay)293A是均勻的一層,，沒有細胞重疊和細胞空隙(hole),，就這個意思，這個A所對的是293S(suspension).液氮罐

　　293T細胞表達 E1A蛋白,，S40大T抗原,，含有S40復制起始點與啟動子區(qū)的質(zhì)粒可以復制,。

　　293FT細胞能制造高滴度的慢病毒,。293A細胞來源于人腎纖維母細胞，組成性表達 E1A 和 E1B 蛋白,。

　　QBI-293A細胞培養(yǎng)

　　293A 細胞來源于一個用作空斑測定的亞克隆,，具有易使用和易轉(zhuǎn)染的特性。該細胞株對于高細胞密度很敏感,，當細胞超過70%匯合時,，一些細胞可能會丟失它們的表型,。若細胞密度持續(xù)在70%以下，QBI-293A細胞則能連續(xù)培養(yǎng)3~4個月維持原有細胞特性,。若以購買得到的293作為**代,，則30代內(nèi)能得到**結(jié)果。一旦到了30代,，**復蘇一管細胞開始新的培養(yǎng),。所以，我們建議你在收到細胞后應(yīng)盡快建立自己的QBI-293A細胞庫,。

　    5.1.1 QBI-293A細胞初始培養(yǎng)

　　1. 將凍存的一管QBI-293A細胞在37℃水浴輕輕晃動融化,。

　　2. 融化后在超凈臺無菌條件下用70%乙醇將凍存管的蓋沿擦拭干凈。

　　3. 將細胞轉(zhuǎn)入15mL無菌離心管中,，加入10mL DMEM 10%,，600×g離心5分鐘使細胞沉淀。

　　4. 棄去上清,。

　　5. 將細胞用10mL DMEM 10%重懸,，輕輕打勻

　　6. 轉(zhuǎn)入75cm2培養(yǎng)瓶或100mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。液氮罐

　　7. 在5% CO2孵箱中37℃培養(yǎng)過夜,。

　　8. 第二天觀察細胞匯合率,，若合適則可進行實驗，否則按5.1.2所述繼續(xù)培養(yǎng),。

　　5.1.2 QBI-293A細胞的維持培養(yǎng)和增殖

　　QBI-293A細胞必須按1:10到1:20傳代

　　1. 室溫下胰酶消化1~3分鐘使貼壁細胞脫落

　　2. 拍打培養(yǎng)瓶邊緣使細胞脫落,，在倒置顯微鏡下觀察細胞是否變圓，是否已從培養(yǎng)瓶表面脫落,。

　　3. 按需要用新鮮培養(yǎng)液稀釋細胞懸液,，轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中。在5% FBS中,，細胞倍增的時間是26小時,，在10% FBS中稍短一些。

　　5.1.3 QBI-293A細胞的凍存

　　建立細胞庫時必須使培養(yǎng)的細胞匯合率低于50%,，以保證亞克隆的特定表型,。

　　1. QBI-293A細胞必須在含10%高質(zhì)量FBS的DMEM中培養(yǎng)。

　　2. 將健康生長的QBI-293A細胞離心沉淀,。

　　3. 以最小體積的DMEM 10%重懸細胞,。

　　4. 用血球計數(shù)器進行細胞計數(shù)。

　　5. 用DMEM5% + 10% DMSO + 40% FBS重懸細胞,，細胞終濃度為1×106/mL,。

　　6. 無菌操作將1mL細胞懸液轉(zhuǎn)入2mL凍存管中。

　　7. 將凍存管放入凍存盒中,，-80℃儲存24小時,。這一簡便措施可保持約1℃/分鐘的降溫速率,，適于凍存細胞。

　　8. 第二天將凍存的細胞轉(zhuǎn)入液氮罐或-150℃冰箱中長期保存,。QBI-293A細胞若正確凍存,，則可在液氮罐中保存數(shù)年。液氮罐